iGEM暑期文獻分享（2）：設計無需DSB和供體DNA的基因編輯技術

Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA

設計無需DSB和供體(ti) DNA的基因編輯技術

01、設計背景

目前，大多數基因突變導致的疾病很難同時達到無副作用的有效治療。新興(xing) 的基因編輯治療技術具有一定的局限性。由DNA雙鏈斷裂（double-strand breaks, DSBs）刺激的同源定向修複（homology directed repair, HDR）由於(yu) 依賴供體(ti) DNA，通常會(hui) 通過DSB的末端修複產(chan) 生過量的插入和缺失突變（InDels）；堿基編輯存在堿基過渡轉換類型的局限性且在一定程度上依賴DSB。本文介紹一種“搜索和替換”（Prime Editing, PE）基因組編輯技術，它介導人類細胞中的靶向插入、缺失所以12種可能堿基間轉換以及其組合，而不需要DSBs和供體(ti) DNA。

圖1 Cinvar已知的人類致病基因突變

02、設計內(nei) 容

1、PE的結構

先導編輯係統（prime editor, PE）由逆轉錄酶（RT）區域、pegRNA和Cas9切割區域組成。編輯範圍包括：所有四個(ge) 過渡點突變、轉位點突變、插入、刪除或以上的複合形式。

圖2. 主編輯器

2、PE的作用機理

pegRNA上的間隔序列與(yu) 目標DNA位點雜交，Cas9對其中一條鏈進行定點切割。PegRNA既有指定DNA目標序列，也包含新的遺傳(chuan) 信息。從(cong) pegRNA的3’端啟動逆轉錄插入新的遺傳(chuan) 信息。由此產(chan) 生了一個(ge) 異雙鏈，之後結構特異性內(nei) 切酶可以切割滯後鏈DNA合成和長貼片堿基切除修複過程種產(chan) 生的5’端，多餘(yu) 的5’未編輯的DNA可以被5’外切酶切除。最後通過DNA修複，將編輯鏈中的信息複製到互補鏈上來解決(jue) 異雙鏈的問題，將信息永久存在DNA上。

圖3 PE的作用機理

03、PE的更迭

PE1、融合到Cas9（H840A）鎳酶C端的M-MLV RT

PE2、M-MLV RT的突變可以提高編輯效率。研究在高溫下支持逆轉錄的M-MLV RT變異——D200N、L603W、T330P、T306K和W313F。在PE1裝置中加入這些變體(ti) ，發現編輯效率普遍提高。將該五聚體(ti) 逆轉錄並入PE1【Cas9(H840A)-M-MLVRT(D200N/ L603W/T330P/T306K/W313F】

圖4 PE1和PE2在pegRNA指定的基因組位點上突變結果

上圖實驗為(wei) 測試PE1和PE2在pegRNA指定的另外四個(ge) 基因組位點上引入轉位點突變的能力以及HEK3位點的靶向插入和缺失。

結果表明，PE2安裝單核苷酸轉位、插入和缺失突變，其效率明顯高於(yu) PE1，並與(yu) 較短的PBS序列兼容。

PE3、DNA修複效率也決(jue) 定編輯效率。非編輯的DNA鏈需要進行切割而進行修複，這一過程容易與(yu) 編輯DNA鏈形成DSB。測試非編輯鏈上的各種切割位置，以減少導致InDels的DSB。首先在HEK293T細胞的5個(ge) 基因組位點測試了這種策略，指定為(wei) PE3，使用sgRNAs誘導距離pegrna誘導的缺口位點14-116nt的缺口。

圖5 互補鏈缺口位置對編輯效率的影響

在測試的5個(ge) 位點中，有4個(ge) ，與(yu) PE2相比，切割未編輯鏈的編輯效率提高。最佳的缺口位置根據基因組位點的不同而不同，但距離pegRNA誘導的缺口約40-90bp的編輯缺口通常會(hui) 提高編輯效率，而沒有形成過量的indel。

PE3b、為(wei) 實現在編輯鏈分解後才切割未編輯的鏈，減少同時切割，設計與(yu) 編輯鏈相匹配的間隔子的sgRNAs，而不是原始等位基因，稱為(wei) PE3b。適合應用於(yu) 當編輯位於(yu) 第二個(ge) 原間隔子內(nei) 時。

圖6 PE3和PE3b在兩(liang) 個(ge) 基因組編輯效率的比較

與(yu) PE3相比，PE3b的平均InDels數量減少，但編輯效率沒有明顯下降。

04、與(yu) 堿基編輯的比較及致病突變的應用

經測試，在四種人類細胞係中，HDR的編輯效率通常比PE3的編輯效率低。

圖7 HDR在四類細胞的編輯效率

圖8 PE3在四類細胞的編輯效率

在HEK293T細胞中，PE3安裝或糾正編碼HBB（E6V）或安裝編碼PRNP（G127V）的等位基因的編輯與(yu) indels的比率平均是cas9啟動的HDR的270倍。在除HEK293T外的人類細胞係中，PE3和HDR之間的比較顯示了類似的結果，盡管PE3的編輯效率較低。

圖9 PE在HEK3基因組的編輯應用

在HEK293T細胞中使用PE3精確插入HEK3 a His6標簽，Flag表位標簽和擴展的Cre重組酶loxP位點，且indels為(wei) 3.0-5.9%。這表明可以有效和精確地將新的DNA序列插入活細胞的靶位點。