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文獻標題：

De novo biosesynthesis of complex natural product sakuranetin usingmodular co-culture engineerin

DOI號：

https://doi.org/10.1007/s00253-020-10576-1

關(guan) 鍵詞：

De novo biosesynthesis,sakuranetin,co-cultures, fed-btachfermentation,E.coli-E.coli co-cultures

內(nei) 容摘要：

本篇文獻敘述了通過共培養(yang) 大腸杆菌的方法，將冗長的回路分成兩(liang) 個(ge) 部分，然後以簡單的碳底物——葡萄糖中從(cong) 頭生物合成類黃酮(flavonoids)櫻草素(sakuranetin)。

主要內(nei) 容：

1.前言

櫻花素是一種複雜的天然產(chan) 物，屬於(yu) 類黃酮家族。這種分子是由一些植物自然產(chan) 生的，例如一些灌木和水稻。櫻花素作為(wei) 病原體(ti) 感染的植物抗毒素，已被發現具有多種生物活性，包括抗菌、抗炎、抗誘變、抗幽門螺杆菌、抗利什曼原蟲和抗錐蟲體(ti) 活性等。由於(yu) 其在營養(yang) 保健品和醫藥市場的潛在價(jia) 值，開發高效生物合成櫻草素的方法具有重要的研究意義(yi) 。 

共培養(yang) 工程策略的應用，不涉及通過蛋白質工程等複雜手段修改任何特定途徑酶的活性。它也不需要協調調整不同通路模塊的基因表達強度，例如需要優(you) 化基因啟動子、核糖體(ti) 結合位點或質粒載體(ti) 拷貝數，用於(yu) 通路平衡。而模塊化共培養(yang) 工程是使用菌株與(yu) 菌株的比率操縱來平衡不同途徑模塊的生物合成能力，並實現它們(men) 之間代謝資源的合理分配以優(you) 化生物生產(chan) 。

2.合成回路

櫻花素的生物合成途徑如圖所示。碳底物，例如葡萄糖，首先被通過酪氨酸(tyrosine)途徑製造酪氨酸。隨後，酪氨酸通過酪氨酸解氨酶(tyrosineammonia lyase，TAL)轉化為(wei) 對香豆酸(pcoumaric acid)。

然後通過一係列涉及4-香豆酸-CoA連接酶(4-coumarate-CoA ligase，4CL)、丙二酸合成酶(malonate synthetase，MatB)、丙二酸載體(ti) 蛋白 (malonate carrier protein，MatC)、查爾酮合酶 (chalcone synthase，CHS)和查耳酮異構酶 (chalconeisomerase，CHI)的過程，將香豆酸轉化為(wei) 柚皮素(Naringenin)。最後，柚皮素被柚皮素 7-O-甲基轉移酶(naringenin 7-O-methyl-transferaseNOMT）鄰甲基化，生成產(chan) 物櫻花素。總體(ti) 而言，大腸杆菌中櫻花素生物合成需要七種異源酶。

有前人在大腸杆菌中重構此生產(chan) 回路，即以單獨的大腸杆菌去完成櫻花素的生產(chan) ，產(chan) 量為(wei) 40 mg/L。本篇文章中，研究員們(men) 在前人的基礎上做出改進：將原來的合成回路分為(wei) 兩(liang) 個(ge) 部分，分別由兩(liang) 種那個(ge) 大腸杆菌生產(chan) ，最終通過共培養(yang) 這兩(liang) 種大腸杆菌，實現完整產(chan) 物的生產(chan) 。另外，為(wei) 了使反應體(ti) 係更大，研究員們(men) 也將培養(yang) 體(ti) 係放大到2.5 L的分批補料(fed-batch fermentation)中，有不錯的效果。

圖1 櫻花素完整的生產(chan) 回路

 

3.材料與(yu) 方法

3.1回路設計與(yu) 菌種選擇

研究員們(men) 將此回路一分為(wei) 二，即上遊回路和下遊回路。上遊回路是從(cong) 碳底物——葡萄糖開始轉化，一直到香豆酸為(wei) 止。而下遊回路則是從(cong) 香豆素開始轉化，直到最終產(chan) 物櫻花素為(wei) 止。經過實驗測試E.coli P2H, K12(DE3), BL21(DE3)這三種不同種類的菌株，以及他們(men) 的分支菌株的產(chan) 物生產(chan) 效率後，他們(men) 選擇使用來自E.coli P2H的UPB1菌株作為(wei) 上遊菌株(6種菌株種葡萄糖-香豆酸轉化效率最高)。而下遊菌株則選擇來自E.coli BL21-Gold(DE3)的DG2菌株作為(wei) 下遊菌株(四種菌株種香豆素-櫻花素轉化效率最高)。

 

圖2（a)六種上遊菌株的生產(chan) 效率比較

(b)四種下遊菌株的生產(chan) 效率比較

圖3 參與(yu) 測試的菌株及其描述

圖4 UPB1與(yu) DG2菌株所含質粒

3.2培養(yang) 溫度的選擇

在確定上遊和下遊菌株後，研究員們(men) 還分別評估了培養(yang) 溫度對這些菌株生物合成性能的影響。事實上，雖然37 °C是大腸杆菌生長的最佳溫度，但較低的溫度通常會(hui) 通過降低轉錄、翻譯、細胞分裂和蛋白質聚集的速率來減少折疊應力的量，這通常有助於(yu) 異源酶折疊和活動。

他們(men) 首先比較了所選上遊菌株UPB1在25 °C、30 °C和37 °C下的對香豆酸產(chan) 量。後來又在下遊菌株DG2培養(yang) 中補充200 mg/L外源香豆酸，確認其在25 °C,30 °C和37 °C下的轉化效率。結果顯示，兩(liang) 種菌株在30 ℃下都有最好的生產(chan) 效率。

圖5 (c)UPB1在不同溫度下的生產(chan) 效率

(d)DG2在不同溫度下的生產(chan) 效率

3.3共培養(yang) 菌株接種比例的優(you) 化

UPB1為(wei) Cm抗性，而DG2為(wei) Kan抗性。為(wei) 了將兩(liang) 種不同抗性的菌株接種在一起，他們(men) 選擇了一個(ge) 共同抗性——Amp。由於(yu) 下遊菌株是以上遊菌株的產(chan) 物作為(wei) 原料，因此兩(liang) 種菌株的比例對最終產(chan) 物櫻花素的產(chan) 量有很大的影響。通過不同起始接種比例，可以得到不同的產(chan) 物。其中，以上遊:下遊=1:9的比例接種是最佳比例，產(chan) 物含量是其他幾種比例種最高的，培養(yang) 48小時候可以達到11.3mg/L。

3.4後續優(you) 化

後來，他們(men) 又對生產(chan) 回路進行了修飾，提高丙二酰輔酶A的利用率，加強CHS和CHI表達，重構回路分配等，提升了櫻花素的產(chan) 量。

3.5補料分批發酵

圖6 研究補料分批發酵相關(guan) 參數所選擇的上遊和下遊菌株

為(wei) 了研究共培養(yang) 生物合成係統的可擴展性，研究員們(men) 在2.5 L補料分批生物反應器中培養(yang) 了性能最佳的共培養(yang) UPBC:DGS3。同樣的，以1:9的比例將另種菌接種到含10 g/L葡萄糖的MY1培養(yang) 基中生長。在整個(ge) 生物生產(chan) 過程中，監測細胞密度、應變與(yu) 應變比和途徑代謝物濃度的動態變化。

數據如下圖所示，生物反應器中的葡萄糖在 12 小時後迅速耗盡。即使使用外源補料，在剩餘(yu) 的培養(yang) 時間內(nei) 葡萄糖濃度仍保持在較低水平(<0.5 g/L)。

圖7 體(ti) 係中菌株的生長曲線、葡萄糖消耗速率曲線、

產(chan) 物積累速率圖

另一方麵，共培養(yang) 細胞密度在前24小時內(nei) 呈指數增加，這時盡管培養(yang) 物中仍有殘留葡萄糖，但OD600 趨於(yu) 穩定=6。同時，上遊菌株亞(ya) 群的百分比從(cong) 0小時的10%穩定增加到16小時的38%。在剩下的培養(yang) 期間，菌群數量的波動在30%到38%之間。這種生長趨勢表明上遊共培養(yang) 菌株在培養(yang) 初期生長速度相對快於(yu) 下遊菌株，但16 h後生長優(you) 勢消失。

此外，盡管培養(yang) 物中葡萄糖積累存在動態變化，但細胞密度和應變與(yu) 應變比在28小時後保持穩定。因此表明，在適應的培養(yang) 條件下，共培養(yang) 種群增長對葡萄糖濃度變化不敏感，並且工程化共培養(yang) 在放大後具有所需的種群穩定性。即按一定的比例接種，最後的菌群比例也會(hui) 趨於(yu) 大約的穩定比例(當然這也取決(jue) 於(yu) 菌的代謝壓力和其他因素)。

4.結果

總而言之，使用補料分批發酵方法，共培養(yang) 大腸杆菌生產(chan) 櫻花素有不錯的效率，其產(chan) 量明顯較單一培養(yang) 發酵更高。

個(ge) 人評價(jia) ：

本篇文獻的研究與(yu) 設計和我們(men) 的課題有很多相似之處。可以認為(wei) ，我們(men) 課題中的BL21(DE3)就是上遊菌株，用於(yu) 生產(chan) HA(透明質酸)，而Nissle 1917就是下遊菌株，用於(yu) 生產(chan) BC(細菌纖維素)。在形成BC 的過程中，體(ti) 係中的HA對BC進行同位修飾，最終得到BC/HA的交聯產(chan) 物。因此我認為(wei) ，本篇文獻有很多可參考點。如構建整個(ge) 共培養(yang) 體(ti) 係的思路，能夠幫助我們(men) 完善後續的設計。

同時，先前無法解決(jue) 的菌群比例調控問題也有一個(ge) 參考。如果不能有更好的調控菌群比例的方法，可以考慮參考這篇文獻，測試不同的菌群比例對產(chan) 物的影響，後以一定的比例去接種兩(liang) 種工程菌，希望也有很好的結果。