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文獻標題：

Bacterial cellulosehyaluronic acid nanocomposites production throughco-culturing Gluconacetobacter hansenii and Lactococcus lactis in a two-vesselcirculating syste

DOI號：

10.1016/j.biortech.2019.121715

關(guan) 鍵詞：

Bacterial cellulose，Hyaluronic acid，Co-cult，uring Lactococcus lactis，Bioreactor

內(nei) 容摘要：

通過在設計雙容器循環中共培養(yang) 漢森氏葡萄糖酸菌(Gluconacetobacterhansenii，以下簡稱G.hansenii)以及乳酸菌(Lactococcus lactis，以下簡稱L.lactis)，實現細菌纖維素(bacterial cellulose，以下簡稱BC)與(yu) 透明質酸(Hyaluronic acid，以下簡稱HA)的交聯，製造出擁有更良好物理性能的BC/HA複合材料。

主要內(nei) 容：

1.前言

由2022BNUZH的課題，他們(men) 使用殼聚糖和HA對生產(chan) 出來的BC進行修飾，以增強BC的物理和機械性能。經組會(hui) 討論，考慮到殼聚糖對大腸杆菌而言是有毒性的，因此我將目光轉向HA。HA就是在護膚品中的玻尿酸的別名，其保水能力是廣為(wei) 人知的。由於(yu) 我們(men) 計劃生產(chan) BC是作為(wei) 保水劑使用，因此使用 HA修飾BC，一方麵能夠提升BC的物理和機械性能(尤其提升BC的保水性能)，一方麵又能夠實現生產(chan) 雙保水劑，可謂一箭雙雕。

不過，BC如何與(yu) HA交聯是一個(ge) 問題，目前常用手段是將已經純化的HA加入到BC中，然後通過添加化學藥劑，促進HA與(yu) BC的交聯，最終得到一個(ge) BC/HA的網狀結構。這個(ge) 存在的問題是，額外添加HA，會(hui) 有成本過高的問題，這與(yu) 我們(men) 想要生產(chan) 低成本保水劑的初衷背道而馳。同時，使用化學藥劑促進交聯工序繁瑣，不適合應用在我們(men) 的生物工廠中。因此，這篇文獻中提到的共培養(yang) 、自主交聯的辦法，就很符合我們(men) 的設想。通過閱讀文獻，希望能夠發現可以應用在我們(men) 設計中的部分，實現我們(men) 的設想。

2.BC與(yu) HA

細菌纖維素(BC)因其高純度、生物相容性和優(you) 異的機械性能而引起了研究人員的興(xing) 趣。基於(yu) BC的納米複合材料是一個(ge) 很有前景的研究課題，目前廣泛研究的複合材料包括BC/海藻酸鹽BC/膠原蛋白/羥基磷灰石、BC/殼聚糖、肝素化BC、甘露糖化BC、BC/聚苯胺、BC/普魯蘭(lan) 多糖和BC/木葡聚糖。這些BC 的納米複合材料已應用於(yu) 生物醫學領域，在改善生物相容性、細胞附著和成纖維細胞生長到人造血管、傷(shang) 口敷料和組織再生方麵都有應用。

透明質酸(HA)，又稱玻尿酸，是一種線性多糖，由 D-葡萄糖醛酸(D-glucuronicacid)和N-乙酰基-D-氨基葡萄糖(N-acetyl-D-glucosamine)的雙糖重複單元組成，對細胞生長、增殖和傷(shang) 口愈合具有有益作用。BC/HA納米複合材料是通過在BC的生物合成過程中在培養(yang) 基中添加純化的HA，或將BC薄膜浸入HA溶液中製備的。不過，由於(yu) 市場上HA的價(jia) 格十分昂貴，額外添加HA會(hui) 導致生產(chan) BC/HA複合材料的成本顯著升高。

生物技術中廣泛使用的方法——共培養(yang) 發酵，為(wei) 這裏生產(chan) BC/HA成本高的問題提供了良方。通過在適當培養(yang) 條件下共培養(yang) G.hansenii和L.lactis，發酵過程中可直接形成BC/HA納米複合材料。

3.共培養(yang) 方法

3.1激動狀態和靜止狀態

通常，培養(yang) 生產(chan) BC的細菌時，根據培養(yang) 方法可分為(wei) 兩(liang) 個(ge) 大方向——激動狀態和靜止狀態。在攪拌培養(yang) 基中，溶解氧(DO)和pH值可以在必要時進行監測和調整。還可以提供葡萄糖等其他營養(yang) 物質並充分混合以支持菌株的生長。同時根據攪拌方法的不同，合成的細菌纖維素的形狀可以是多種形式，包括多形漿狀物、纖維狀物和橢圓形顆粒狀物。

靜態條件下，BC在空氣和介質界麵產(chan) 生，形成凝膠狀薄膜。這些BC薄膜有更大的內(nei) 表麵積，保持著規則的形狀和完整的三維結構，因此有更好的機械強度和保水性能。也就是說，動態培養(yang) 下生產(chan) 的BC機械性能略遜於(yu) 靜態培養(yang) 下生產(chan) 的BC。但是，在靜態培養(yang) 基中，隻能調整有少數參數，包括溫度、pH 初始值和不同營養(yang) 素的初始濃度，其可控性不如動態培養(yang) 。

文獻使用的是靜態培養(yang) 和動態培養(yang) 的結合方法，這是通過他們(men) 自己設計的裝置來完成的。不過，考慮到我們(men) 的保水劑不需要那麽(me) 精細的結構，以及調配溶液與(yu) 排放保水劑時難易度，綜合考慮下來，我認為(wei) 我們(men) 的設計中應該使用動態培養(yang) 法，更易於(yu) 操控，後處理也比較容易。

3.2 共培養(yang) 方法

這是在他們(men) 雙容器循環裝置中完成的(詳細設計見下項)。

3.2.1 菌株與(yu) 培養(yang) 基的準備

1.G.hansenii ATCC 23769來自美國類型培養(yang) 集(ATCC)。

2.L.lactis APJ3是Chauhan等人用乳酸菌MG1363 和來自Bioneer(丹麥)的質粒pAMJ399構建。

3.配置標準Hestrin-Schramm(HS)培養(yang) 基。混合 20.0 g/L葡萄糖、5.0 g/L細菌蛋白腖(bacterial peptone)、5.0 g/L酵母提取物、2.7 g/L磷酸鈉二鹽 基、1.15 g/L檸檬酸和1.0 g/L硫酸鎂，然後用鹽酸調節pH值至5.0。

4.配置HS瓊脂培養(yang) 基。在標準HS培養(yang) 基中加入1.5%(w/v)瓊脂和紅黴素(Sigma-Aldrich)，最終濃度為(wei) 2 μg/mL。

5.配置改良的M17培養(yang) 基。混合30 g/L的葡萄糖，2.5 g/L的酪蛋白腖(casein tryptone)，2.5 g/L的細菌蛋白腖，5 g/L的大豆蛋白腖，2.5 g/L酵母提取 物，5 g/L牛肉提取物，0.5 g/L抗壞血酸，0.22 g/L硫酸鎂，19.1g/Lβ-甘油磷酸鈉，3.5g/L檸檬酸，8.97g/L磷酸二鈉。

6.配置葡萄糖溶液533 g/L、267 g/L和133 g/L。

7.上步葡萄糖溶液將在共培養(yang) 時，分別以0.067 g/h、0.033 g/h和0.017 g/h的速度不斷加入到發酵係統中。(這裏設計的進料速率是依據HA的最佳配比：0.5%、0.2%、0.1%至0.05%(w/v)計算得來)

3.2 具體(ti) 培養(yang) 方法

 

1.在接種共培養(yang) 時，G.hansenii和L.lactis之間的菌落形成單位(CFU)設定為(wei) 1:1。

2.對於(yu) G.hansenii，將10 mLHS培養(yang) 基、34 µL解凍的冷凍原液和34 µL纖維素酶(Sigma-Aldrich)混合並在30°C和250 rpm下搖動，直到600 nm波長下的光密度(OD)達到0.90(7.2±3.4×107 CFU/mL)。

3.通過用等體(ti) 積的新鮮HS培養(yang) 基清洗菌株三次，去除培養(yang) 基中的纖維素酶。

4.離心4500×g，4℃，5min，收集菌株。

5. 對於(yu) L.lactis，首先將其解凍的冷凍原液接種到含有2µg/mL紅黴素的HS瓊脂平板上，以選擇含有轉移質粒的菌株。

6. 將平板放在30℃的培養(yang) 箱中24至36小時。挑選在瓊脂平板上形成的菌落，接種到5 mL含有2 μg/mL 紅黴素的新鮮HS培養(yang) 基中，在30 ℃和250 rpm下培養(yang) 過夜。

7. 將另外10 mL含有2 µg/mL紅黴素的新鮮HS培養(yang) 基接種到1%(v/v)的過夜培養(yang) 基中，並在30℃和250 rpm下搖動，直到OD600nm的值達到0.66，此時菌株處於(yu) 早期對數階段(3.4±0.2×107 CFU/mL)

8.當開始共培養(yang) 時，將1 mLG.hansenii的原代培養(yang) 物和1 mLL.lactis的原代培養(yang) 物接種到每100 mL改良的M17培養(yang) 基中，其中還含有2 μg/mL紅黴素。

9.在30 ℃下運行雙容器循環係統7天後，收集纖維素小球並在80 ℃下用0.1 M NaOH溶液清洗1hr。

10.堿處理重複一次，然後用去離子(DI)水衝(chong) 洗，直到達到pH7.0。

11.純化的纖維素被冷凍幹燥(Freezoom2.5 L, Labconco)，精確稱重(AE240,Mettler Toledo)，並儲(chu) 存在幹燥器中，以便進一步分析。

12.G.hansenii和L.lactis共培養(yang) 產(chan) 生的纖維素被標記為(wei) Co BC，而來自G.hansenii單培養(yang) 的纖維素，作為(wei) 對照組，被標記為(wei) 23769 BC。

13.在相同的條件下，同時進行乳酸菌APJ3的單培養(yang) ，作純HA的對照。

4. 儀(yi) 器設計

文獻中記述了一種雙容器循環係統的設計。這個(ge) 係統允許G.hansenii在空氣—液體(ti) 界麵生產(chan) 纖維素薄膜，同時為(wei) 共培養(yang) 菌株L.lactis提供氧氣和葡萄糖，使其能夠生長和生產(chan) HA。係統包含的部件如下：

圖1 雙容器循環係統

係統使用時，濕空氣和葡萄糖被供應到空氣側(ce) (左邊的容器)，通過劇烈的氣泡混合，最後在培養(yang) 基中循環分布。BC在BC側(ce) (右側(ce) 容器)的空氣和液體(ti) 的界麵上生長。黑色箭頭表示培養(yang) 基的流動方向。虛線箭頭表示濕空氣的流動方向。

*備注：雖然蠕動泵在兩(liang) 個(ge) 吸液瓶之間循環培養(yang) 基，但在BC側(ce) 容器中保持相對靜止的狀態，並且在氣液界麵合成了BC薄膜。

5. 物理性質測試結果

5.1 X 射線衍射

研究人員通過X射線衍射測試了Co BC的晶體(ti) 信息。結果表明，Co BC的晶體(ti) 尺寸比23769 BC大。研究人員猜測，是因為(wei) HA通過使微纖維緊密靠近，促進共結晶，從(cong) 而形成更大的晶體(ti) 。同時作為(wei) 線性聚合物的HA也可以沿微纖維的長度以線性方式結合，從(cong) 而使微纖維緊密排列，同時促進共結晶。

5.2 FESEM 圖像

23769 BC和Co BC的表麵形貌通過FESEM圖像呈現。作為(wei) 對照樣品的23769 BC表現出多孔纖維素網絡，而與(yu) 23769 BC相比，在Co BC樣品中

觀察到具有更小孔徑和更大條帶的更密集網絡。同時，他們(men) 也觀察到，隨著葡萄糖的恒定進料速率從(cong) 0.067 g/h降低到0.033 g/h或0.017 g/h，共培養(yang) 的乳酸乳球菌合成的HA下降，Co BC中的孔徑呈增大趨勢。

5.3失重分析研究

通過失重分析研究了Co BC的持水能力。在所有葡萄糖進料速率下的23769BC樣品在60分鍾後幾乎完全幹燥。當HA隨著濃度的增加而整合時，Co BC需要更長的時間才能完全幹燥。研究發現，在0.067 g/h組下生產(chan) 的Co BC顯示出最長的時間，即需要120分鍾才能失去所有的水。與(yu) 23769 BC相比，Co BC增強的持水能力可能與(yu) HA的保水性能和這些納米複合材料中更小的孔徑的組合有關(guan) 。

圖2 23769 BC和Co BC在0.067 g/h、0.033g/h和0.017g/h的恒定葡萄糖進料速率下的重量損失分析(n=3）

個(ge) 人評價(jia) ：

總的來說，共培養(yang) 生成BC/HA自主交聯的納米複合材料，相比純BC，有著晶粒更大、網間孔徑更小、保水性能更好的優(you) 點。這就完全符合我們(men) 想對BC修飾的初衷，換而言之，HA 也完全符合我們(men) 對修飾物的要求與(yu) 期許。因此可以考慮應用HA到我們(men) 的設計中。

根據文獻中記述，BC/HA的HA含量在0.5%、0.2%、0.1%至0.05%(w/v)範圍內(nei) ，已有很好的醫療效果(保水、修護等)，尤其以0.1%和0.05%HA最佳。因此我推測，在我們(men) 計劃合成的保水劑BC/HA 中，HA作為(wei) 修飾和輔助也無需過量。因此配合大腸杆菌生產(chan) HA，就無需再增加它的產(chan) 量，隻要能合成

就行，這就大大降低我們(men) 的工作難度。

並且，在實際應用階段，我們(men) 無需再對BC/HA進行表征，則實驗操作中洗脫和純化的部分可以省略。共培養(yang) 數天(時間縮短還需要再測試)後，直接將培養(yang) 出的產(chan) 物加水，配製溶液，就可以投放，這就簡化了我們(men) 的工作流程。

最後，這個(ge) 共培養(yang) 裝置也很適合應用在我們(men) 設計的生物工廠中。諸多細節還需待定，但大體(ti) 方向已經非常明確。