iGEM暑期文獻分享（3）：用於監測體內多巴胺活性的下一代 GRAB 傳感器

用於(yu) 監測體(ti) 內(nei) 多巴胺活性的下一代 GRAB 傳(chuan) 感器

Next-generation GRAB sensors for monitoring dopaminergic activity in vivo

多巴胺（DA）在大腦中起著至關(guan) 重要的作用，直接測量多巴胺能活性的能力對於(yu) 了解其生理功能至關(guan) 重要。因此，文章開發了基於(yu) 紅色熒光G蛋白偶聯受體(ti) （GRAB）激活的DA傳(chuan) 感器和以綠色熒光為(wei) 輸出信號的優(you) 化版本傳(chuan) 感器。

為(wei) 了響應細胞外DA，新一代傳(chuan) 感器表現的紅色和綠色都做到了熒光度大幅增加，具有亞(ya) 細胞分辨率、亞(ya) 秒級動力學和納摩爾到亞(ya) 微摩爾的親(qin) 和力。生成了名為(wei) rGRABDA1m的紅色熒光DA傳(chuan) 感器和 rGRABDA1h（分別縮寫(xie) 為(wei) rDA1m和rDA1h），動態範圍類似於(yu) 相應的第一代綠色DA傳(chuan) 感器。

01、DA傳(chuan) 感器的開發和體(ti) 外表征

文章開發了紅色熒光DA傳(chuan) 感器，將cpmApple(構象敏感的紅色熒光蛋白)表達模塊與(yu) D2R（多巴胺 D2 受體(ti) ）模塊相結合，並係統地優(you) 化了插入位點、接頭序列和cpmApple模塊。文章通過在cpEGFP（構象敏感的綠色熒光蛋白）模塊篩選近1000個(ge) 變體(ti) 產(chan) 生了DA2h，一種高親(qin) 和力的綠色熒光DA傳(chuan) 感器。

圖1 .含傳(chuan) 感器的細胞在顯微鏡下的熒光表現圖像

使用HEK293T細胞和培養(yang) 的大鼠皮質神經元測試傳(chuan) 感器表征效果，由熒光圖像與(yu) 分析來看，文章構建的傳(chuan) 感器在這兩(liang) 種細胞中沒有明顯的熒光降低，具有較好的表征效果。

圖2.在大鼠皮質神經元中傳(chuan) 感器的熒光表征圖

02、急性小鼠腦切片中DA釋放的成像

接下來，文章測試了開發的DA傳(chuan) 感器是否可用於(yu) 測量急性腦切片中內(nei) 源性DA的釋放。將用於(yu) 表達rDA1m，rDA1h或DA2m的AAV注射到NAc中，NAc接受來自中腦多巴胺能神經元的強烈神經支配。注射兩(liang) 周後，製備急性腦切片，並使用光子成像結合電刺激來測量刺激誘發的DA釋放。

圖3.小鼠急性腦切片的研究製備與(yu) 相應傳(chuan) 感器的熒光檢測圖像

03、果蠅中DA的體(ti) 內(nei) 成像

文章生成了表達rDA1m的轉基因果蠅，並使用體(ti) 內(nei) 光子成像測量了rDA2m傳(chuan) 感器的熒光水平，同時呈現生理相關(guan) 的刺激。當提供氣味劑或身體(ti) 電擊時，我們(men) 觀察到果蠅大腦內(nei) 葉的表征多巴胺活性的熒光增加。

圖4.二代優(you) 化傳(chuan) 感器在果蠅體(ti) 內(nei) 的熒光檢測圖

文章比較了第一代和第二代綠色熒光DA傳(chuan) 感器在蒼蠅中的體(ti) 內(nei) 性能。與(yu) 表達DA2m的果蠅相比，電刺激引起附近表達DA傳(chuan) 感器的多巴胺能神經元（DANs）的強烈熒光增加，在表達DA1m的果蠅中觀察到更高的反應。

圖5.第一代傳(chuan) 感器在果蠅體(ti) 內(nei) 的熒光檢測

04、檢測自由行為(wei) 小鼠中的DA釋放

文章測試傳(chuan) 感器在小鼠體(ti) 內(nei) 的性能，通過表達光遺傳(chuan) 學工具C1V1測量了背紋狀體(ti) 中的DA動力學，這是反映黑質致密部（SNc）多巴胺活性的主要靶標。

圖6.自由小鼠傳(chuan) 感器構建檢測思路圖

為(wei) 了比較自然行為(wei) 過程中DA2h和DA1h傳(chuan) 感器的性能，文章在NAc磁芯的相對兩(liang) 側(ce) 表達DA1h和DA2h，並在雄性小鼠交配期間對其進行了傳(chuan) 感器記錄。通過數據分析得出結論，rDA1m能夠檢測自然行為(wei) 過程中體(ti) 內(nei) DA的釋放，並且紅色和綠色DA傳(chuan) 感器檢測到的行為(wei) 相關(guan) DA響應在程度上相似。

圖7.利用性行為(wei) 小鼠比較兩(liang) 種傳(chuan) 感器性能思路圖