Aqualose-帝國理工學院2014年iGEM課題項目簡介

課題：Aqualose: Customisable Ultrafiltration Membranes from Bacterial Cellulose —— 2014 Imperial College London

主要內(nei) 容：利用木醋杆菌的基因修飾大腸杆菌，使大腸杆菌具有生產(chan) BC 的能力。

Wiki網址：https://2014.igem.org/Team:Imperial

關(guan) 鍵詞：BC、acsABCD、E. coli、Gluconacetobacter Xylinus

本次閱讀目標：了解如何修飾 E. coli，使其能具有更好的BC生產(chan) 效率。同時思考利用野生木醋杆菌作為(wei) 工程菌的可能性。

引言

Introduction

此課題生產(chan) 的產(chan) 物與(yu) 我們(men) 相同，也是細菌纖維素。同時，也同我們(men) 一樣，利用了木糖醋杆菌（簡稱木醋杆菌）的基因去修飾大腸杆菌。由於(yu) 考慮到我們(men) 目前設計可能存在細菌纖維素（以下簡稱 BC）產(chan) 率不足的問題，因此想從(cong) 本篇課題中尋找其他提高產(chan) 量的方法。

大腸杆菌是合成生物學的首選生物體(ti) 。它具有全麵的特性，易於(yu) 設計。一些大腸杆菌菌株已進化為(wei) 產(chan) 生少量纖維素，但其機製受到特定調控係統控製（其分泌通常與(yu) 生物膜形成和應激情況有關(guan) ）。考慮到細菌纖維素的利用價(jia) 值，以及大腸杆菌在生長上的優(you) 勢，課題組嚐試將擁有高 BC 產(chan) 量的木醋杆菌的係統，轉移到大腸杆菌中，並使其發揮作用。

經過研究與(yu) 學習(xi) ，課題組確認木糖醋杆菌的高產(chan) 纖維素生產(chan) 機製可以轉移到其他生物體(ti) 中。最後，使用了剛果紅結合測定，證明了大腸杆菌中產(chan) 生 Acs 纖維素的操縱子的功能。簡單來說，本課題中，成功在大腸杆菌中組裝了一個(ge) 全合成的、功能性的纖維素生產(chan) 係統。

設計

Design

該課題組的設計理念為(wei) ：將木醋杆菌中的 Acs 操縱子移植到大腸杆菌中。具體(ti) 實現方法為(wei) ，將 acs A 和 acs B 連接在一個(ge) 骨架上，而 acs C 與(yu) acs D 連接在一個(ge) 骨架上，相當於(yu) 是把操縱子拆成兩(liang) 個(ge) 部分，並且可以分開誘導表達。

a. Acs 操縱子

Acs 操縱子是木糖醋杆菌中的纖維素生產(chan) 操縱子是一個(ge) 10kb 的基因組區域，由四個(ge) 主要元件組成：acs A、acs B、acs C、acs D。

i. acs AB 被稱為(wei) 纖維素合成酶，由兩(liang) 個(ge) 結構域組成：acs A 是催化結構域，acs B 是環二鳥苷酸（c-di-GMP）結合結構域。這種模塊化的酶需要第二信使環二鳥苷酸，以進行有效的催化。

ii. acs C 編碼一個(ge) 低聚物元素，它被嵌入細胞外膜，並允許生長的聚合物穿過細胞膜運輸到細胞外環境

iii. acs D 被認為(wei) 是一個(ge) 非必需的元素，盡管在控製纖維素結晶度起關(guan) 鍵作用，並且是維持纖維素最大生產(chan) 力所需要的部件。

Acs AB 嵌入細胞質膜中，並在附著細胞質中的葡萄糖單體(ti) 時將生長的聚合物輸送通過膜。在缺乏 Acs C 和 Acs D 的情況下，纖維素無法分泌到環境中，則纖維素應該會(hui) 積聚在細胞的周質中。

b. 分子克隆部分

i. 準備工作

課題組首先在 NCBI 中查找出 acs ABCD 四個(ge) 部件的基因序列，並進行一些大腸杆菌優(you) 化，去除一些天然調節。這是由於(yu) 天然操縱子在轉錄、翻譯和翻譯後水平上受到高度調控。同時，經過模擬計算後，發現該啟動子區域自帶的核糖體(ti) 結合位點（ribosome binding site, RBS）較弱。因此後續也用強 RBS —— B0034 替代。

ii. 組裝

為(wei) 了更便於(yu) 調控，同時減小對工程菌的負擔，課題組將啟動子的四個(ge) 區域分為(wei) 了兩(liang) 組。一組 acs A, acs B，組裝到 pSB1C3（高拷貝）骨架上，並由 pBAD 啟動子調控；一組 acs C，acs D，組裝到 pSB3K3（低拷貝）骨架上，並由 pLAC啟動子控製。構建結果如下所示。

圖1：acs AB 和 acs CD 回路示意圖

圖2：acs AB 和 acs CD 回路的質粒圖譜

c.表征與(yu) 結果

回路構建好後，先將 acs AB 的回路轉化到 DH10β 中，後製備成電轉化感受態。隨後將 acs CD 的回路利用電轉化的方法轉入 DH10β 中，如此以來，就獲得含有 acs AB 和 acs CD 回路的 DH10β 菌株了。

準備 LB 平板，剛果紅終濃度為(wei) 20 μM，並添加有 0.1 % 阿拉伯糖、0.5 mM IPTG、50 μg/mL  氯黴素、25 μg/mL 卡那黴素和 1 % 葡萄糖，用來做 DH10β 的 BC 生產(chan) 的定性表征。此外，課題組也利用剛果紅測試了 acs AB 的功能，以此探索單獨的 Acs AB 元件是否足以實現纖維素生產(chan) 。

結果表明，兩(liang) 個(ge) 回路都在 DH10β 菌株中正常表達，剛果紅測試顯示陽性結果。

圖3：BC表征實驗（左：陰性對照-空載體(ti) 右：實驗對象- DH10β - acs ABCD）

另外，實驗結果也表明，缺乏 Acs CD 的菌株無法將 BC 分泌出胞外。這可以從(cong) 實驗數據中看出。BC 無法分泌出胞外，則無剛果紅與(yu) BC 結合，其在 490 nm 的吸收峰（遊離剛果紅的最大吸收峰）也毫無差別。值得一提的是，在這個(ge) 實驗中，課題組還對不同溫度下誘導表達 BC 的情況進行了測試。結果表明，低溫狀態（30℃）下纖維素合酶折疊和發揮功能的情況可能是最佳的，其能產(chan) 生的 BC 與(yu) 剛果紅結合，使得介質中的剛果紅減少，使得 490 nm 處的吸光度降低。從(cong) 數據中看出，吸光度有降低的情況，這說明，在 30℃ 下，Acs AB 還是右一些活性的，即使大腸杆菌的最佳生長溫度是 37℃ 。

圖4：Acs AB的功能測試

（從(cong) 左到右：空載體(ti) ，未誘導的acs AB回路，誘導的acs AB回路）

圖5：30 ℃ 情況下膜組分在 490 nm 下的吸光度

（左：空載體(ti) ，右：誘導的 Acs AB）

思考

Thought

此課題利用木醋杆菌的基因改良了大腸杆菌，是另一種改良大腸杆菌的方法。雖然我們(men) 也用了類似的方法（引入 bcs AB），但目前仍擔心僅(jin) 僅(jin) 這樣還不足以達到很高的產(chan) 量。我們(men) 也考慮過直接使用野生的木醋杆菌，目前希望還寄托在 EcNP 上，希望搭配環二鳥苷酸能有好的結果。後續再就環二鳥苷酸如何應用以及發揮效用繼續探究。