E.co LIVE-新加坡國立大學2020年iGEM課題 項目簡介

課題：2020NUS_Singapore

主要內(nei) 容：

為(wei) 細胞設計啟動開關(guan) ，從(cong) 而能夠控製其生產(chan) 力並延長其生產(chan) 壽命。

關(guan) 鍵詞：

毒素-抗毒素係統；生長控製；營養(yang) 代謝；生物遏製

一、概述

研究發現部分大腸杆菌在長期使用的未更新培養(yang) 基中仍然能夠存活，該課題假設營養(yang) 負荷是導致細胞死亡的根本原因，通過操縱細胞的代謝狀態來減緩不必要的營養(yang) 消耗或保存細胞資源的方法是延長細胞壽命的關(guan) 鍵。於(yu) 是，利用毒素抗毒素和葡萄糖抑製係統創建了一個(ge) “開關(guan) ”和一個(ge) 可調“旋鈕”，為(wei) 合成生物學提供了一種嚴(yan) 格控製細胞生長的方法。

二、生長控製係統

1.毒素-抗毒素係統

HicA-HicB：大腸杆菌內(nei) 源表達。HicA毒素可以與(yu) mRNA中的特定序列結合並降解它們(men) ，從(cong) 而降低蛋白質的翻譯率，全細胞翻譯的減少將導致增長總體(ti) 下降。HicB抗毒素通過與(yu) HicA毒素結合來中和HicA毒素的作用。在正常的細胞條件下，與(yu) HicA毒素相比，HicB抗毒素的含量更高，因此可以生長。在壓力情況下，HicB抗毒素的降解速度比HicA毒素快，因為(wei) 它的結構不太穩定，導致生長停止。隨後的HicB表達已被證明可以誘導生長恢複，這表明HicA-HicB係統本質上是抑菌的。

圖1：HicA-HicB在正常和應力狀態下的作用機製

RES-Xre：大腸杆菌外源表達。RES毒素作為(wei) NAD酶會(hui) 降低NAD⁺的胞內(nei) 水平，從(cong) 而阻止生長。隨後，在Xre中和RES後，NAD⁺可能會(hui) 被上調（由於(yu) 蛋白質複合物中存在Helix-Turn-Helix DNA結合結構域，抗毒素同樣參與(yu) 其自身的基因調節）——導致累積資源（如葡萄糖、ATP等）的使用，從(cong) 而產(chan) 生和生長蛋白質。

圖2：RES-Xre在正常和應力狀態下的作用機製

2.葡萄糖吸收係統

除了考慮到毒素對下撥生長的抑製外，葡萄糖攝入量也可能限製細胞生長。在大腸杆菌中，葡萄糖的攝入由PtsG葡萄糖轉運體(ti) 調節。大腸杆菌通過兩(liang) 種機製調節PtsG的活性和表達。首先，細胞會(hui) 產(chan) 生一種被稱為(wei) SgrS的小RNA直接與(yu) PtsG mRNA相互作用並導致其降解，導致PtsG蛋白濃度降低。此外，還發現SgrS RNA編碼一種被稱為(wei) SgrT的蛋白質，該蛋白質也與(yu) PtsG蛋白相互作用，抑製其功能。

圖3：SgrS作用機製

三、模塊化調控元件

使用化學誘導和藍光誘導作為(wei) 開關(guan) ，在化學誘導中，使用乳糖和阿拉伯糖來控製毒素和抗毒素誘導，而由於(yu) 阿拉伯糖和葡萄糖的混淆作用，選擇Tet操縱子用來控製SgrS係統。在藍光誘導中，該課題使用了藍光EL222係統，該係統能夠通過EL222 DNA結合蛋白的光活化二聚化來控製基因表達，以調節抗毒素的表達。藍光係統的主要優(you) 點是它是可逆的，允許打開和關(guan) 閉抗毒素的表達，並延伸到細胞生長。

圖4：化學誘導雙穩態開關(guan)

圖5：藍光誘導機製

四、細菌的質粒保留和生物遏製

目前使用抗生素作為(wei) 選擇壓力使細胞保留質粒的方法有明顯弊端，因為(wei) 抗生素會(hui) 隨著時間的推移而降解，如果長期儲(chu) 存在室溫下，大多數抗生素是無效的。此外，為(wei) 了誘導抗生素耐藥性，抗性基因必須轉化入細胞，而水平基因轉移將會(hui) 導致抗性的種間傳(chuan) 播。故而除使用抗生素之外用於(yu) 讓細菌保留質粒的方法是被需要的。

研究表明，與(yu) 野生型相比，某些毒素-抗毒素對能夠顯著增加細胞中保留質粒的持續時間，本課題決(jue) 定使用另一組毒素-抗毒素係統，與(yu) 上述調節“開/關(guan) ”開關(guan) 的可控模塊分開。在這個(ge) 係統中，毒素-抗毒素對本身起到選擇壓力的作用。這樣一來帶有所需模塊的質粒也會(hui) 被選擇性地保留在細胞中，並且雙毒素-抗毒素係統能夠起到生物遏製的作用。

圖6：生物遏製係統

從(cong) 上圖可以看出，隻有當兩(liang) 種質粒同時存在於(yu) 細胞內(nei) 時細胞才能夠存活，因此，成功水平基因轉移的幾率大大降低。此外，該係統通過加倍作為(wei) 保留質粒的一種方式，消除了對抗生素耐藥性的需求，從(cong) 而進一步降低釋放到環境中的危險性。

對於(yu) 這個(ge) 保留和生物封閉模塊中使用的毒素-毒素係統，使用了Txe-Axe和Hok-Sok毒素-抗毒素係統。兩(liang) 者都據稱具有殺菌性質。還有研究發現這兩(liang) 個(ge) 係統都能夠提高插入該係統的質粒的保留率（假設在不同質粒上交換毒素和相應的抗毒素可能會(hui) 產(chan) 生更顯著的保留和殺傷(shang) 效果，故而該課題沒有將與(yu) 睡眠-喚醒模塊相同的毒素係統用於(yu) 這個(ge) 遏製和保留係統，為(wei) 了避免兩(liang) 者之間有任何可能的幹擾，這將使描述它們(men) 的個(ge) 體(ti) 影響變得困難。）但是這個(ge) 生物遏製係統隻能防止遺傳(chuan) 回路傳(chuan) 播到外部環境。並不能防止菌本身的意外擴散，結合自殺回路則可以。

五、結果

1.turn off：IPTG誘導下HicA-HicB係統和RES-Xre係統顯示出顯著的增長，細胞生長被顯著抑製。（但是由於(yu) 細胞內(nei) 可能存在反饋係統以應對NAD⁺水平的下降，故在誘導後10小時出現了細胞生長）

2.turn on：在誘導毒素表達兩(liang) 個(ge) 半小時後誘導了抗毒素基因的表達，抗毒素表達誘導的生長停止細胞顯示出生長的恢複。並且通過測定抗毒素表達前後的CFU，結果表明即使在生長停止10天後，生長截斷的細胞仍然能夠保持活力，在誘導抗毒素表達後保持生長和分裂的能力，證明毒素是在不殺死細胞的情況下觸發生長停滯。

圖7：【Turn off】

圖8：【Turn on】

3.誘導前後蛋白表達情況對比

圖9：（a）HicA毒素表達在1小時時誘導的生長停止生長細胞的生長曲線顯示（b）總GFP和（c）平均GFP生產(chan) 率下降，表明細胞生長的抑製抑製了其蛋白質的產(chan) 生速度。（d）與(yu) 正常生長的對照細胞相比，HicA介導的生長停止細胞的蛋白質生產(chan) 水平（最大-初始）明顯較低。

4.優(you) 化藍光可控係統作為(wei) 生長開關(guan) 的替代輸入

圖10：將該藍光抑製啟動子放在HicB基因前，HicA基因仍在IPTG誘導啟動子的控製之下。藍光的存在會(hui) 導致HicB生成減少，則菌生長抑製。

圖11：【Turn off】

圖12：【Turn on】

圖13：當生長停止的細胞保持在黑暗中並測量12小時時，藍光控製生長開關(guan) 對（a）細胞生長（b）總蛋白質產(chan) 量和（c）平均蛋白質產(chan) 量的影響。

六、個(ge) 人評價(jia)

總結一下就是，雙毒素-抗毒素係統防止HGT並代替抗生素保留質粒、毒素-抗毒素+葡萄糖吸收係統生長控製。我們(men) 正在糾結調控兩(liang) 種菌的機製該怎麽(me) 設計，而且抗生素本身的使用也是很大的問題，根據這個(ge) 課題，或許可以想出一些其他的方法。